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本研究プログラムにおける中心研究者(山海嘉之)が『サイバニクス』技術を駆使した最先端人支援技術研究を推進する上で必要な研究テーマをそれぞれの分野の先生に加わっていただき、推進しています。

中枢神経再生のための基礎研究

Mikhailov Andrey

最先端サイバニクス研究拠点 准教授(専門:細胞生物学)

金子 愛

最先端サイバニクス研究拠点 助教(専門:臨床医学 基礎医学)

脳・脊髄よりなる中枢神経系は、一度損傷を受けるとほとんど再生しないと考えられていました。人間にとって非常に重要な機能を司るこの中枢神経を再生させ、脊髄損傷患者等の機能を回復させることは、極めて重要な課題です。我々は、一昨年より研究室の立ち上げを行い、本研究課題に基礎的な領域から取り組んでいます。その内容は、下記の2テーマです:
1)神経細胞の初代培養
2)脊髄損傷実験

1)神経細胞の初代培養
目的:生体内での脊髄神経(軸索)の再生を調べるため、まずin vitro(生体外)での神経細胞の初代培養を行い、その軸索突起が再生・伸長する条件を検討した。初代培養とは、生体から採取した細胞を生体外で培養することであり、その生体内での性質が維持されているため、特に神経科学の分野では重要な役割を果たしてきた。初代神経細胞の分化と成熟、シナプス形成等を研究するためには、3〜5週間の長期培養が必要である。さらに、個々の神経細胞間のネットワークや活動電位等を調べるためには、低密度で培養する必要がある。しかし、低密度の初代神経細胞は、数日以内に大半が死滅するため、長期培養が極めて困難である。
 本研究では、この困難な初代神経細胞の長期・低密度培養を行うため、培養の足場として、ナノファイバーを形成する三次元ハイドロゲルを使用した。生体内の細胞は、ナノファイバー等からなる細胞外マトリックス(ECM)上で成長するので、生体外においても、この構造に近い三次元の足場で培養するのが好適であり、より生体内の条件を再現しうると考えられている。
 材料として、ラット胎児(妊娠18日目、E18)の海馬を採取し、酵素分散処理を行うことによって、初代神経細胞の懸濁液を調製し、三次元ハイドロゲルに低密度で播種し、培養を行った。

結果:ラット胎児海馬初代神経細胞は6週間以上生存し、神経突起(軸索突起)を最長2,000μm以上にまで伸長させた。通常の、平面のプラスチック容器等で培養した場合、長期培養の間にグリア 細胞が増殖する問題があるが、本実験系ではグリア細胞の増殖も抑制された。  下図は、三次元ハイドロゲルで培養した神経細胞(培養42日目)の蛍光染色画像である。生細胞が緑に染色され、死細胞が赤で示される。6週間の長期培養後も、多数の生細胞が存在し、突起を1,600μm以上に伸長させた(矢印)。



2)脊髄損傷実験
目的:1)では生体外での神経軸索の再生を調べたが、ここでは実験動物(ラット)を使用し、実際の生体内(in vivo)での脊髄再生を調べる。具体的には、ラットに脊髄損傷の手術を施し、損傷部位に神経再生の足場を移植し、脊髄神経の再生及び運動機能の回復を調べ、それらが良好な足場を検討した。
足場の材料:ハイドロゲル、ナノファイバー、ナノ粒子、細胞、人工神経管を単独で、又は組み合わせて使用する。まず、前記1)で検討した三次元ハイドロゲルを使用した。
方法:ラットの第10胸椎(T10)において、脊髄の完全切断を行った。その損傷部分(ギャップ)に、脊髄神経再生のための足場を移植した。対照(control)として、足場の替わりにPBSを注入し、足場の効果を調べた。ラットは、手術後には後肢麻痺の状態になるが、その後の運動機能の回復を数ヶ月にわたって評価した。評価方法は、BBB scale(脊髄損傷ラットの後肢運動機能の回復度のscore)を使用した。また、脊髄損傷部位の脊髄組織を採取し、神経の再生を免疫組織学的に評価した。
結果:足場移植群と対照群で後肢運動機能の回復を比較すると、足場移植群の回復度(BBB score)が有意に高く、足場の効果が示された。両群の有意差は、手術の3〜4週間後から現れた。脊髄組織においては、足場部分に多数の神経細胞が見られ、神経の再生が組織学的に示された。

■足場移植群の例(脊髄損傷手術の3ヶ月後):良好な後肢運動機能の回復が見られた。後肢3関節の広範囲な動き、左右の後肢を交互に動かした這う動きや、足の甲を接地する動きも見られた。

















■対照群の例(脊髄損傷手術の3ヶ月後):後肢はほとんど動きがなく、引きずって移動した。




















■足場移植群の脊髄組織(脊髄損傷の5週間後):足場移植部分に神経細胞(緑)が多数侵入・再生していた。
左図:正常脊髄と足場移植部分の蛍光画像。左側が尾側。
右図:左図の足場移植部分(□)の高倍率蛍光画像。




















Dramatic decline in quality of life, a prognosis of life-long dependence, heavy burden for the society taken together with the fact that many sufferers are young, previously active people are only the starting factors to consider when overlooking the benefits of novel therapeutic approaches for treatment of the spinal cord injuries. Main directions of research and development in the biology group of CCR are: a rational design of the cell scaffolds for cell based therapies, in situ stem cell transformation for nerve regeneration, fabrication of the cell-selective electrodes, and improving the clinical outcomes for the cell transplantation therapies.

Regeneration and reconnection of the injured nerves are still challenging tasks despite the stunning progress in both material development and micro-surgical procedures. An ideal implant should provide the complex regenerative assistance, including physical guidance for axon outgrowth; be a reservoir for the factors attracting/inducing stem cells as well as the tissue-forming factors; provide a matrix for cell attachment; be traceable; and finally to disintegrate when the regeneration is complete. We are developing the assemblies from the set of the functional materials with defined nano- and macro-properties into the individually tailored implant structures. These structures are to be well tolerated on both cell and tissue levels, slowly releasing their macromolecular cargo, traceable by MRI, and mechanically sound.

Chitosan-based materials are practical, well tolerated and could be adapted to the specific needs of the regenerative medicine. Complex design including structural, functional and traceable materials combination is able to provide a mechanical guidance, controllable release of tissue-forming stimuli, cell attachment as well as surrounding tissue tolerance for the duration of material`s life. We have demonstrated that the inclusion of the negatively charged biopolymers (acidic glycoprotein serum fractions, poly-glutamic acid, and some purified proteins: vimentin, fetuin, HSC-70) into the chitosan scaffold significantly improves the attachment of all tested cell lines as well as their viability comparing to the scaffolds from pure chitosan. Implanting of these scaffolds into rats showed good tolerance on both acute 2-day test (minor local aseptic inflammation) and chronic 14-day test (no pain or inflammation on implanting site, no animal weight loss). In vivo tested scaffold designs were loaded with allogeneic cell suspension and also implanted into rats. Cell loaded scaffolds induced higher initial inflammation over the sham ones, possible due to massive death of implanted cells, however, in 14-days test inflammation and weight returned to the levels in sham scaffold experiments. When GFP-labelled cell were used for implantation, cell viability and vascularization at the site of implantation were confirmed after 2 weeks.

Material compositions similar to ones used for the hydrogel scaffolds were employed for building architected structures for cell hosting/guidance. For making these structures in vivo monitorable we have chemically conjugated chitosan with diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), loaded the casted structures with gadolinium (Gd3+) and sterilized with ethanol. Washed with physiologic saline the structures were implanted subcutaneously into dorsal part of the rats. Structures (nerve guidance conduit prototypes – protoconduits) were tolerable by host animals on both acute and 14-day chronic tests. In both cases structures were clearly detectable in MRI with the resolution high enough to allow the detection of the tubular structure of 4.5mm ⊘ protoconduits. Recently developed by CCR steel mold allowed us to reduce the diameter of the protoconduits down to 2.7-3mm with 1-1.3mm central channel, roughly corresponding to the rat spinal cord size.

Guidance of the cell migration and axon grows in the developing organism is conducted through the gradients of macromolecular chemical signals. To provide such guidance at the site of injury and prospective repair we have to deliver the stable gradients of liable growth factors. One of the ways to achieve it is to include these proteins into slowly degrading materials. We have assembled several generations of chitosan/pentasodium triphosphate (Cht/PSTP) and glycol-chitosan/poly-acrylic acid nanoparticles with inclusion of two model proteins: heat shock cognate protein 70 (KDa) and bovine serum albumin. Optimizing composition, size and load it was possible to achieve prolonged release of the protein from these nanoparticles over 7 days period. Similarly, 50-150nm nanoparticles loaded with DNA vectors carrying stem cell transforming factors are under testing now. Stem cell based interventions give promise for the future regenerative applications, however, the main obstacles for today implementations are low numbers of the available cells and even lower number of the cells surviving the implantation due to lack of oxygen, nutrients, excess of the inflammatory cytokines and free oxygen radical species in cell environment. We are addressing the problem from two angles: designing compounds promoting survival of transplanted cells over the critical time post implantation, as well as assembling the complex micro and nanostructures for in situ induction of the stem cells directly at the site of injury or lesion.





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